Fragment

Denaturation

Circulation (×30)

Extension

Tet^R

94˚C 5 min

94˚C 30 s, 47˚C 30 s, 72˚C 1 min

72˚C 10 min

ack

94˚C 30 s, 50˚C 30 s, 72˚C 1 min

upsteam fragment

94˚C 30 s, 52˚C 30 s, 72˚C 30 s

downsteam fragment

94˚C 30 s, 52˚C 30 s, 72˚C 30 s

recombination confirmation

94˚C 30 s, 50˚C 30 s, 72˚C 90 s